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| 3. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL |
| Fernando Lopes Gonçales Junior1 Neiva Sellan Lopes Gonçales1 Norma de Paula Cavalheiro2 1Grupo de Estudos das Hepatites - MI/FCM/Unicamp. 2Laboratório de Hepatites - LIM-47 - HC/FMUSP. a. Testes indiretos e diretos Atualmente, duas categorias de testes são utilizadas para o diagnóstico de pacientes infectados pelo vírus da hepatite C (VHC). Testes indiretos, que detectam anticorpos contra o VHC e testes diretos que detectam, quantificam ou caracterizam componentes da partícula viral, tais como a pesquisa do RNA do VHC e o teste de detecção do antígeno do core do VHC. Estes testes são importantes no diagnóstico da infecção, indicação terapêutica e no seguimento e avaliação da resposta virológica à terapêutica. Os anticorpos anti-HCV são habitualmente detectados utilizando-se ensaios imunoenzimáticos de segunda (EIA/ELISA-2) e terceira (EIA/ELISA-3) gerações, os quais contêm antígenos do core e genes não-estruturais do VHC. Nos testes de EIA que detectam o anti-HCV, disponíveis no mercado, a determinação da especificidade foi maior que 99%. Já a sua sensibilidade foi de 95%-99%, sendo mais difícil de determinar devido à ausência de testes padrão ouro de alta sensibilidade. Diferentes testes baseados em reação em cadeia da polimerase (PCR) têm sido desenvolvidos para detectar diretamente o RNA viral. A detecção qualitativa do RNA do VHC por RT-PCR é geralmente aceita como o teste mais sensível e padronizado, até agora. Apesar disso, existe variabilidade dos resultados entre laboratórios, como pode ser evidenciado pela utilização de painéis internacionais de proficiência. A acurácia e a confiabilidade dos resultados estão diretamente envolvidas com os procedimentos laboratoriais adotados na execução dos testes. A falta de cuidados preliminares na coleta das amostras, associada com o tempo de preparo e separação das amostras, pode ocasionar resultados incorretos. É de extrema importância que todos os procedimentos laboratoriais obedeçam às Boas Práticas de Laboratório e sigam rigorosamente os protocolos padronizados pelos fabricantes dos conjuntos diagnósticos e reagentes. O uso cuidadoso da PCR padronizada para a detecção do RNA do VHC e dos testes EIA-2 e EIA-3 (especificidade aliada a sensibilidade) fazem juntos o padrão ouro. Estudos realizados em nosso meio mostraram que em EIA-2 repetidamente reagentes com a relação DO/CO > 3 se associam a 100% de resultados verdadeiros-positivos (valor preditivo positivo) e apresentam em torno de 92% de positividade para o RNA do VHC por RT-PCR. O valor preditivo positivo aumenta em relação à população estudada quando associado a fatores de risco, ALT elevadas e presença de doença hepática. Os testes de EIA-2 e EIA-3 apresentam excelente reprodutibilidade em pacientes imunocompetentes, porém em pacientes hemodialisados e/ou imunocomprometidos a sensibilidade se reduz. Em populações de baixo risco, como doadores de sangue ou em triagens populacionais aleatórias, que não apresentam fatores de risco para aquisição de infecção pelo VHC, o EIA negativo é suficiente para excluir a presença do VHC. Entretanto, resultados falsos-positivos podem ocorrer nestas populações. Nestes casos, a pesquisa do RNA do VHC qualitativa deve ser realizada para confirmar o diagnóstico. Em populações de alto risco, quando existe suspeita clínica de infecção pelo VHC, a positividade do EIA confirma a exposição ao VHC. A pesquisa do RNA do VHC qualitativa deve ser realizada para identificar os indivíduos com infecção crônica dos que eliminaram o VHC espontaneamente. Em pacientes com hepatite crônica de causas desconhecidas com EIA anti-HCV negativo, em particular em pacientes imunocomprometidos, a pesquisa do RNA do VHC qualitativa deve ser realizada. A presença do RNA do VHC confirma o diagnóstico, porém um resultado negativo não exclui a infecção pelo VHC. Nestes casos, uma nova pesquisa do RNA do VHC é recomendada, seis meses após a primeira investigação. Os ensaios de detecção qualitativa do RNA do VHC são ferramentas importantes porque são significativamente mais sensíveis que a maioria dos testes quantitativos. Os ensaios qualitativos estão baseados no princípio de amplificação do alvo usando ou a PCR ou a amplificação mediada por transcrição (TMA). O valor de corte (cut-off) do limite inferior de detecção do RNA do VHC destes ensaios comerciais é de 50 UI/ml e 10 UI/ml, respectivamente. A especificidade destes ensaios excede a 98%. Um único teste positivo para o RNA do VHC confirma a replicação ativa do VHC, mas um resultado negativo isolado não garante que o paciente não é virêmico. Um seguimento com a pesquisa do RNA do VHC deverá ser feito para confirmar a ausência da replicação ativa do VHC. Uma vez confirmada a infecção pelo VHC, a repetição do teste qualitativo para RNA do VHC, em pacientes em seguimento, porém sem tratamento, não apresenta nenhuma utilidade diagnóstica. A maioria dos pacientes permanece virêmicos e um resultado negativo pode meramente refletir um declínio transiente na carga viral abaixo do limite de detecção do ensaio utilizado. A quantificação do nível de RNA do VHC pode ser feita pela amplificação do alvo (PCR ou TMA) ou pela técnica de amplificação do sinal (branched DNA). Nestes ensaios comerciais, o valor de corte (cut-off) de quantificacão do RNA do VHC, no limite inferior, varia entre 30 UI/ml e 615 UI/ml, e o limite linear superior é de 500.000 UI/ml e 7.700.000 UI/ml. A padronização em UI não representa o número atual de partículas virais na preparação. Existem variações significativas entre ensaios comerciais. A dinâmica de cada ensaio deve ser observada e diluições apropriadas do material em análise devem ser feitas para garantir a acurácia da quantificação. Recentemente, um teste de detecção e quantificação do antígeno total do core do VHC, por EIA, foi desenvolvido. Este teste pode detectar e quantificar o antígeno do VHC, em títulos de pg/ml, e tem uma correlação bastante próxima com o nível de RNA do VHC, podendo ser usado como um marcador indireto de replicação viral. A versão apresentada atualmente não permite detecções abaixo de 20.000 UI/ml. A determinação molecular dos genótipos do VHC pode ser feita pela análise direta da seqüência genômica, pela hibridização reversa sobre sondas de oligonucleotídeos genótipo-específicas. A hibridização reversa é um produto comercial que permite a determinação fácil e rápida dos 6 genótipos e seus subtipos. O ensaio é baseado nas variações encontradas na região 5’ não codificadora (5’NCR) de diferentes genótipos do HCV. Este ensaio permite a interpretação em 100% dos casos. O seqüenciamento, considerado padrão ouro, baseado na região 5’NC, também discrimina os tipos e subtipos do VHC com segurança. Esta metodologia, comercialmente disponível para pesquisa, está associada a um programa de computador para análise e comparação dos produtos de PCR amplificados e seqüenciados. O teste de genotipagem apresenta importância clínica, principalmente em relação ao tempo e resposta à terapêutica com interferon. Também pode ser feita a determinação sorológica dos genótipos pela detecção de anticorpos tipo-específicos, usando um EIA competitivo (Sorotipagem). Este ensaio permite interpretar os resultados em 90% dos casos de pacientes imunocompetentes com hepatite crônica pelo VHC. A sensibilidade deste ensaio é menor em pacientes hemodialisados e imunocomprometidos. Este teste identifica os tipos, mas não os subtipos. b. Infecção aguda e acidente perfurocortante Após exposição ao VHC, os anticorpos anti-HCV podem ser detectados pelo EIA-2 e 3 em 50% a 70% dos pacientes no início dos sintomas, aumentando para aproximadamente 90% após três meses. O RNA do VHC pode ser detectado no sangue em uma a três semanas após exposição e está presente no início dos sintomas. A ALT apresenta níveis acima dos valores normais de duas a oito semanas após a infecção e cursa concomitante com o início das lesões hepatocíticas. c. Transmissão vertical Uma questão importante é como exatamente se define a transmissão materno-infantil da infecção pelo VHC. Muitas crianças nascidas de mães com infecção crônica pelo VHC apresentam o anti-HCV detectável (IgG) no sangue adquirido por transferência passiva transplacentária. Estes anticorpos adquiridos passivamente continuarão a ser detectáveis na criança nos primeiros 12 a 15 meses de vida. Assim, o critério para identificar a transmissão materno-infantil da infecção pelo VHC será a detecção do anti-HCV e do RNA do VHC no sangue da criança, após os 18 meses de vida. d. Infecção crônica Em pacientes com doença hepática crônica, o diagnóstico de hepatite crônica pelo VHC deve ser baseado na detecção do anti-HCV e do RNA do VHC no sangue, usando técnicas de alta sensibilidade. A perda do anti-HCV e a presença isolada do RNA do VHC é incomum em pacientes imunocompetentes com hepatite crônica pelo VHC, porém pode ocorrer em hemodialisados e pacientes com profunda imunodeficiência. e. Acompanhamento da terapêutica Somente pacientes com RNA do VHC detectável devem ser considerados para o tratamento. A determinação da genotipagem deve ser feita no início do tratamento para auxiliar na decisão do tratamento e sua duração. Isto porque existe uma alta taxa de resposta, após 24 semanas de terapêutica, em pacientes com genótipos 2 e 3 do VHC, enquanto no genótipo 1 são necessárias 48 semanas de terapêutica para que se obtenha uma resposta adequada. A quantificação do RNA do VHC deve ser feita na amostra pré-tratamento e na 12a. semana com o propósito de avaliar o valor preditivo de resposta à terapêutica. A pesquisa do RNA do VHC qualitativa deverá ser feita no início do tratamento, ao final, e seis meses após o término do tratamento (resposta virológica sustentada). |