INTRODUÇÃO

A maior parte da evolução no diagnóstico e tratamento do câncer de mama ocorreu no séc. XX. De 1894 a 1994 - da introdução da cirurgia de Halsted à identificação do BRCA1 - aconteceram avanços notáveis que constituem páginas brilhantes da História da Medicina. Recordemos alguns desses avanços. Evoluímos de uma demolidora mastectomia radical para o conceito de “cirurgia mamária mínima”: uma pequena tumorectomia e biópsia do linfonodo sentinela, acrescida de radioterapia⁽¹⁾. Melhoramos a reconstrução pós-mastectomia e incorporamos técnicas de cirurgia plástica ao tratamento conservador, aperfeiçoando os resultados estéticos⁽²⁾. Saímos de uma era de diagnóstico só através da palpação e da biópsia operatória para a detecção de lesões pequenas pela mamografia, auxiliada pelo ultra-som e pela ressonância magnética⁽³⁾. Para quem só tinha a congelação e a exérese cirúrgica, foi muito bom dispor da punção com agulha fina e da “core-biopsy”. Veio o tratamento adjuvante com a quimioterapia e, principalmente, o tamoxifeno – a droga anticâncer mais útil em todos os tempos. Os inibidores da aromatase estão chegando. A radioterapia progrediu. Diminuiu a mortalidade. Enfim, o tratamento do câncer de mama se humanizou e as mulheres melhoraram.

Apesar desse progresso, ainda estamos usando terapêuticas pouco seletivas, para não dizer pouco inteligentes. Aplicamos, por exemplo, quimioterapia em quem não precisa porque não sabemos quais mulheres têm micrometástases ocultas. Importantes metanálises de ensaios randomizados e vários estudos retrospectivos não controlados indicam que aproximadamente 70% das mulheres sem comprometimento dos gânglios axilares estão vivas e livres de doença dez anos após a cirurgia sem nenhum tipo de tratamento adjuvante e, apesar disso, muitas delas o recebem⁽⁴⁾. Todas as pacientes submetidas à cirurgia conservadora são irradiadas por não termos condições de separar aquelas que, realmente, irão se beneficiar. Em resumo, prescrevemos a mesma terapêutica para grandes grupos de doentes com características diferentes. Somente as classificamos pelo seu estado menstrual e pelo receptor hormonal e elas recebem, a varrer, esquemas iguais, mais tóxicos ou menos tóxicos, sob a justificativa de que o inimigo é muito poderoso. Aqui reside o próximo avanço, a grande mudança paradigmática no tratamento do câncer no 3º milênio.

A ERA DA BIOLOGIA MOLECULAR

Nos últimos anos, a medicina tem-se desenvolvido de maneira a incorporar tecnologias de ponta, como o uso da Biologia Molecular, para estudar diretamente o DNA, buscando o diagnóstico mais precoce e mais preciso de inúmeras doenças, auxiliando no entendimento de sua patogênese e trazendo novas perspectivas para um tratamento ou prevenção mais eficazes⁽⁵⁾. Os avanços no campo da biologia molecular permitiram a detecção direta de seqüências de DNA específicas encontradas em indivíduos com história familiar e/ou pessoal de câncer de mama. Aqui cabe destacar a importância da técnica da reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction-PCR), que tem o potencial valor de amplificar o DNA ainda no material clínico e, com isto, permitir o diagnóstico e, num futuro próximo, obter dados para avaliação prognóstica.

A utilização de DNA genômico, extraído a partir de sangue total dos indivíduos, é importante quando da investigação de mutações hereditárias, uma vez que as mesmas estarão presentes em todas as células do indivíduo, sendo este material de fácil coleta e manuseio. Um dos métodos que têm sido largamente utilizados baseia-se na precipitação de proteínas celulares pela desidratação e precipitação com acetato de amônia saturado, descrito por Miller⁽⁶⁾. O sangue total é colocado em tubo contendo EDTA e pode ser utilizado imediatamente ou armazenado a -200C para posterior extração de DNA.

A extração de DNA genômico, a partir de tecido fresco, congelado ou fixado em parafina, é utilizada para a identificação de mutações somáticas que estão presentes apenas no tecido afetado. Uma vez extraído, o DNA genômico pode ser armazenado a uma temperatura de -20°C por longos períodos de tempo. Quando da impossibilidade do uso de “kits” comerciais, é viável a adaptação de técnicas para extração a partir de sangue periférico. O isolamento de RNA também pode ser obtido através da utilização de “kits” específicos ou então por procedimentos padrões que utilizam ácido guanidínio tiocianeto-fenol-cloroformio, descrito por Chomczynski e Sacchi⁽⁸⁾.

O seqüenciamento direto do DNA é considerado o “padrão ouro” para que se possa definir a seqüência de uma alteração em nível de DNA. Vários métodos foram desenvolvidos para o seqüenciamento manual, sendo um dos mais utilizados o de Sanger, baseado na terminação de cadeia⁽⁸⁾.

A implicação da tecnologia molecular para a prática clínica envolvendo estratégias para prognóstico, diagnóstico precoce e tratamento tem-se deparado com inúmeras dificuldades. Neoplasias quase sempre acumulam uma série de mutações genéticas durante o processo de carcinogênese e, durante a transformação, vários subclones de células tumorais se desenvolvem, algumas das quais podem ter um “make-up” genético muito diferente. Anormalidades genéticas individuais são muitas vezes apenas importantes em etapas específicas durante a evolução do tumor, sugerindo que a substituição da função gênica como uma estratégia terapêutica deve ter apenas uma janela terapêutica bastante estreita.

A FARMACOGENÉTICA

Baseado nisto e na informação científica hoje disponível de que as respostas específicas a medicamentos que variam de indivíduo para indivíduo de acordo com a “constituição genética” do tumor (farmacogenética), fica salientada a importância da criação de bancos de DNA de pacientes-índices, onde a identificação da mutação específica poderá primeiramente auxiliar no tratamento do indivíduo, além, é claro, de possibilitar a identificação da possível mutação específica daquele grupo familiar⁽⁹⁾. A justificativa de utilizar ferramentas de análise molecular para doenças como o câncer de mama pode ser ilustrada através das seguintes afirmativas:

Identificar as diversas lesões gênicas presentes nos pacientes que apresentam uma história familiar, pessoal ou tendência ao câncer, através da análise e identificação dos genes envolvidos (BRCA1, BRCA2 e p53).

Definir uma estratégia, baseada em testes moleculares para o diagnóstico precoce preciso dos pacientes afetados, para a detecção de portadores, para seguimento e para planejamento terapêutico.

Correlacionar as alterações encontradas com os aspectos histológicos e com a evolução da doença dos pacientes (correlação genótipo-fenótipo), contribuindo para uma previsão do prognóstico e para uma melhor definição da estratégia do tratamento em cada caso.

Correlacionar as alterações encontradas nos tecidos afetados com aquelas presentes nas células germinativas para cada paciente com vistas a diagnosticar aqueles com um “background genético” e um risco maior de vir a desenvolver o câncer.

Analisar populações específicas quanto à existência de um “efeito fundador” que possa propiciar um maior risco ao desenvolvimento do câncer no indivíduo de determinada comunidade e familiares.

OS MARCADORES TUMORAIS

Tem havido, então, intensa procura de marcadores tumorais, tanto de prognóstico como de predição de resposta ao tratamento. Vários deles buscaram lugar junto aos consagrados receptores hormonais, mas somente um, em 1998, se destacou e veio representar uma revolução conceitual na abordagem do câncer de mama: o Her2neu e seu anticorpo monoclonal, o trastuzumab (Herceptin). Pela primeira vez, um enfoque sistêmico mais inteligente, dirigido a alvo especifico, entrou na prática clínica, embora de uso restrito aos 25% de tumores que amplificam o oncogene⁽¹⁰⁾.

A proteômica, que é o estudo do conjunto de proteínas expressado em uma célula, emergiu como uma ferramenta notável para descobrir novos marcadores moleculares graças à introdução da espectometria de massa combinada com a identificação de proteínas através da bioinformática avançada^(11-13).

A velocidade com que essas transformações estão acontecendo – e a sua importância – levantam a possibilidade de que as mesmas sejam aplicadas a posteriori às nossas pacientes. Recentes pesquisas salientaram a importância da correlação entre a análise da chamada “assinatura genética” e o prognóstico do câncer de mama ^(14,15) O maior obstáculo para a universalização da assinatura genética e outras técnicas é a exigência de tecido fresco para a análise. O padrão atual de manuseio das peças é a fixação em formalina, mas para os “microarray” de DNA, a amostra de tecido fresco é mandatória. Segundo Sauter e Simon, “necessita-se desesperadamente de uma mudança global no manejo do tecido tumoral e este será o principal desafio para o emergente campo da patologia molecular preditiva”(16). Isto levou à idéia de se armazenar tecido neoplásico e tecido sadio frescos e amostras de sangue em bancos biológicos com a finalidade não só de estudo como de assistência clínica.

OS BANCOS DE TECIDOS

Bancos de tecidos de câncer de mama (ovário inclusive com vistas às síndromes hereditárias) estão sendo criados ao redor do mundo para atender a essa necessidade. Vários grupos internacionais de pesquisa (NSABP, BIG, IBCSG e outros) estão formando ou já formaram os seus bancos, congregando centenas de centros de tratamento de câncer de mama. Existem, inclusive, bancos privados que fornecem dados de epidemiologia molecular de populações inteiras com finalidade de pesquisa. A idéia é que se estabeleçam bancos “regionais” e “centrais” para a referência das amostras com o intuito de evitar a superposição de esforços, representada pela criação de um banco em cada hospital. Assim sendo, todas as instituições que tratam dessa enfermidade devem se preparar para oferecer esse recurso à população feminina. Martine Piccart, recentemente, declarou que “Nesta era da genômica/proteômica, a falta de um coleta prospectiva de amostras congeladas do tumor pode até mesmo ser considerada como não-ética⁽¹⁷⁾.

OPERACIONALIZAÇÃO

No Serviço de Mastologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, foi inaugurado, em julho de 2003, após aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa, o primeiro banco de tecidos em câncer de mama brasileiro com essas características, de forma que todas as pacientes operadas de câncer de mama tenham a possibilidade de ter estocado um fragmento do tumor, do tecido sadio e uma amostra de sangue.

O funcionamento do banco começa com uma avaliação ambulatorial (ver fluxograma) de todas as doentes que serão submetidas a cirurgia por carcinoma mamário. Nesta ocasião, é obtido o consentimento livre e informado, são coletados os dados de identificação geral e o perfil clínico-genético, bem como uma amostra de sangue periférico para o Banco de DNA. O material destinado ao Banco de Tecidos (fragmento de tecido sadio) é colhido pelo cirurgião responsável no Bloco Cirúrgico. Já o material para o Banco de DNA de tecido tumoral é retirado pelo patologista, de tal forma que a amostra não interfira nos procedimentos diagnósticos rotineiros. Todas as amostras são enviadas ao Laboratório Banco de Tecidos/DNA no Centro de Pesquisas do HCPA, onde são armazenadas em “freezer” em temperaturas de -20°C (sangue periférico) e de -80°C (tecido). Concomitantemente, todas as informações são lançadas em um banco de dados informatizado, o qual permitirá intercâmbio com outros bancos para comparações geográficas de epidemiologia molecular.





Essa estrutura constitui uma excelente plataforma de pesquisa avançada para os nossos investigadores e, muito importante, uma fonte de resgate das características moleculares do tumor que poderão, no futuro, beneficiar as pacientes e seus familiares do ponto de vista clínico-assistencial.

REFERÊNCIAS

1. Veronesi U, Cascinelli N, Mariani L et al. Twenty-year follow-up of a randomized study comparing breast-conserving surgery with radical mastectomy for early breast cancer. N Engl J Med 2002;347:1227-32.
2. Biazús JV, Menke CH, Cavalheiro JÁ, Rabin EG. Esthetic surgery and breast conservation. In: Figueira Filho AS, Novais Dias E, Salvador Silva HM, Barros AC (eds) Mastology – Breast Diseases. Amsterdam: Elsevier 1995;382-84.
3. Menke CH, Biazús JV, Xavier NL et al. Rotinas em Mastologia. Porto Alegre, Artes Médicas, 2000.
4. Benz C, Clark G, Conzen S et al. Consensus Statement: Expedition Inspiration Fund for Breast Cancer Research Meeting 2002. Breast Cancer Res Treat 2003;78(1):127-131.
5. International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001;409:860-921.
6. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988 Feb 11;16(3):1215.
7. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987 Apr;162(1):156-9.
8. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Ntl Acad Sci USA 1977 Dec;74(12)5463-7.
9. Fey M. Impact of the Human Genome Project on the clinical management of sporadic breast cancers. Lancet Oncol 2002;3:349-356.
10. Thor AD, Berry DA, Budman DR, et al. ErB2, p53 and efficacy of adjuvant therapy in lymph node positive breast cancer. J Ntl Cancer Inst 1998;90:1346-60.
11. Wooster R, Weber BL. Genomic Medicine: Breast and Ovarian Cancer. N Engl J Med 2003;348:2339-2347.
12. Yazidi-Belkoura IE, Adriaenssens E, Vercoutter-Edouard AS et al. Proteomics of breast cancer: outcomes and prospects. Technol Cancer Res Treat 2002;1(4):287-96.
13. Dua K, Williams TM, Beretta L. Translational control of the proteome: relevance to cancer. Proteomics 2001;1:1191-99.
14. Van de Vijver MJ, He YD, Van't Veer LJ et al. A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 2002;347:1999-2009.
15. Ramaswamy S, Perou CM. DNA microarrays in breast cancer: the promise of personalised medicine. Lancet 2003;361(9369):1576-7.
16. Sauter G, Simon R. Predictive Molecular Pathology (Perspective). N Eng J Med 2002;347:1995-96.
17. Piccart M. Tissue Banks and Breast Cancer: TransBIG Project 2002. (Accessed January 26, 2004 at www.breastinternationalgroup.org)