Oncologia

Prof. Dr. Gilberto Schwartsmann

INTRODUÇÃO

A bombesina é um peptídeo isolado por Anastasi et al. a partir da pele de sapo Bombina bombina em 1971.⁽¹⁾ Estudos imunoistoquímicos mostraram a presença de receptores para a bombesina (imunorreatividade) no Sistema Nervoso Central (SNC) e no trato gastrointestinal (TGI) em várias espécies, incluindo ratos, porcos, cachorros e humanos. Um análogo mamífero da bombesina, com potente atividade liberadora de gastrina, o peptídeo liberador de gastrina (GRP), foi caracterizado quimicamente em 1978 a partir do tecido gástrico de suínos por McDonald et al.⁽²⁾

O GRP, sigla em inglês de gastrin releasing peptide, e a bombesina têm em comum nove de dez aminoácidos C-terminais. Contudo esta imunorreatividade não é devida somente à bombesina, mas também aos peptídeos relacionados: peptídeo gastrina-relacionado (GRP), decapeptídeo neuromedina-B (NMB) e neuromedina C (NMC). Todos esses peptídeos fazem parte da família dos peptídeos relacionados à bombesina (BNPs) (Figura 1).

O GRP apresenta várias atividades biológicas, incluindo a habilidade de suprimir a ingesta de alimentos. A introdução exógena de bombesina gera múltiplas respostas, incluindo a regulação da secreção exócrina e endócrina pelo trato gastrointestinal, pâncreas exócrino, contração da musculatura lisa, pressão arterial, glicemia e temperatura corporal. A bombesina é biologicamente ativa no SNC, onde tem ação neuromoduladora. A NMB e o GRP regulam uma variedade de ações periféricas e centrais, tanto quanto o crescimento autócrino, saciedade, ansiedade e depressão.⁽³⁾

Os BNPs também podem agir como mitógenos, alterando a proliferação de células normais e malignas, como demonstrado no carcinoma pulmonar de pequenas células (CPPC), no carcinoma pulmonar não-pequenas células (CPNPC) e outros tumores humanos, como o câncer de pâncreas, próstata, mama e estômago, funcionando como fatores de crescimento autócrino. Os BNPs estão também envolvidos no desenvolvimento pulmonar embrionário.^(4,5,6)

EFEITOS DO RC-3095 EM NEOPLASIAS

Efeitos Antitumorais dos Antagonistas dos BNPs

O efeito antineoplásico de análogos de peptídeo hormonais depende da presença dos receptores específicos nas células tumorais.⁽⁷⁾ A identificação de padrões de expressão destes receptores é essencial para a aferição da eficácia de tratamentos baseados no uso de antagonistas de receptores de BNPs. Neste sentido, foram demonstrados receptores específicos para BNP/GRP em vários tipos de cânceres humanos, como pulmão, ovário, próstata e outros.^(8,9,10,11)

Um estudo de expressão de mRNA para três tipos de receptores de BN/GRP em câncer de ovário humano indica que esses receptores são amplamente distribuídos nestes tumores. Outros estudos mostraram uma relação entre a expressão de receptores de BNPs e o crescimento autócrino do tumor.^(11,12) Essa relação foi também demonstrada em neoplasia pulmonar, pancreática, prostática, mamária e em glioblastoma multiforme.^(13,14,15)Estes resultados incentivaram os pesquisadores da área a buscar a síntese de antagonistas específicos de receptores de BN/GRP, com fins terapêuticos nestas neoplasias.

Nos últimos anos foram desenvolvidos vários antagonistas de receptores de BN/GRP. A modificação da ponte peptídica C-terminal (situada entre resíduos 13 e 14) resulta em um efeito antagonístico de receptores BNPs potente. A incorporação de um D-aminoácido à cadeia curta N-terminal gera uma potência inibitória adicional. Outros antagonistas foram desenvolvidos substituindo o terminal Met-NH2 com um éster alquila ou um amido alquila.⁽¹⁶⁾Usando modelos tumorais experimentais foram achados vários antagonistas de BNPs capazes de inibir o crescimento de vários tumores humanos.^(17,18,19)

O RC-3095 Como Protótipo dos Antagonistas Sintéticos de BNPs

Até o presente, dentre os antagonistas da bombesina, o RC-3095 (Figura 2) mostrou ser um dos de maior potência terapêutica.^(20,21,22)Este antagonista sintético faz parte da família dos pseudononapeptídeos BN/ GRP (Figura 3). O RC-3095 foi sintetizado através de uma técnica de fase sólida da resina benzidrilamina no laboratório de Schally (Universidade de Tulane, New Orleans). O RC-3095 exerce potente atividade inibitória em uma ampla variedade de neoplasias humanas que incluem linhagens estrógeno-dependentes e estrógeno-independentes em ratos,^(23,24) câncer pancreático induzido por nitrosaminas em “hamsters”,^(25,26) câncer prostático androgênio-independente R-3327-AT-1 em ratos,⁽²⁷⁾ câncer de cólon HT-29,⁽²⁸⁾ câncer prostático PC-3, PC-82 e DU-145,^(29,30) câncer pancreático humano CFPAC-1 e SW-19990,^(28,29) e linhagens de câncer gástrico MKN-45.⁽³¹⁾

Os Receptores do Tipo BNPs e Suas Relações Com Outros Receptores

O fator de crescimento epidérmico, em inglês – “epidermal growth factor” (EGF) – é um agente promotor de crescimento que se liga com alta afinidade ao seu receptor transmembrana específico (EGF-R).⁽³²⁾Uma vez ativado o receptor, há transmissão de sinais mitogênicos para o núcleo celular através da fosforilação de resíduos próprios de tirosina e posteriormente de proteínas intracelulares.⁽³³⁾ Os BNPs produzem aumento na expressão de receptores de EGF e aumentam a fosforilação dos mesmos substratos. Além disto, hiper-regulam a sinalização através da amplificação do sistema tirosina quinase EGF-dependente.⁽³⁴⁾

O EGF e seu receptor são moléculas também implicadas na carcinogênese. A expressão excessiva de EGF-R é sinal de comportamento biológico mais agressivo de alguns tipos de câncer.⁽³⁵⁾ Em muitos modelos experimentais de neoplasia, o tratamento com antagonistas de BNPs produz redução dos EGF-Rs e concomitante inibição do crescimento tumoral.⁽³⁶⁾ O envolvimento de fatores de crescimento como o EGF, assim como o fator de crescimento tipo-insulina I e II (IGF-I e IGF-II) e a bombesina já foram estudados em câncer pulmonar.^(37,38) O efeito inibitório dos antagonistas de BNPs é mediado, ao menos parcialmente, pela interferência na via do EGF-R. O RC-3095 diminui a ligação do EGF com seu receptor e antagoniza os efeitos estimulatórios dos BNPs e do EGF em tumores prostáticos, pancreáticos e de mama.⁽³⁹⁾

O RC-3095 e Avaliação Clínica Inicial

Estudos de toxicidade em animais falharam em identificar uma dose tóxica para esse agente. A dose inicial do RC-3095 para estudos clínicos de fase I foi, portanto, baseada nas doses usadas em animais, doses essas seguras e com atividade antitumoral em vários modelos experimentais.

Os pacientes incluídos no primeiro ensaio clínico fase I foram portadores de tumores sólidos refratários aos tratamentos convencionais. Destes, 13 eram do sexo masculino e 12 do sexo feminino, com mediana de idade de 59 anos (variação de 32-80 anos). A mediana do estado de desempenho da OMS foi 1 (variação de 0-2). Os tipos de tumores foram 14 adenocarcinomas – 2 de cólon, 3 de rim, 2 de pâncreas, 1 de ovário e 6 de próstata; 3 carcinomas ductais invasivos de mama, 1 CPPC, 2 CPC, 1 carcinoma de estômago, 1 carcinoma epidermóide (esôfago), 1 adenocarcinoma medular (tireóide) e 2 sarcomas de partes moles.

No total, foram avaliados 80 ciclos, com uma mediana de 3 ciclos por paciente (variação de 1-5). O RC-3095 foi administrado em grupos consecutivos de pacientes em bolo único através de injeções subcutâneas em 3 diferentes níveis de dose (8 µg/kg de peso, 16 µg/kg de peso e 32 µg/kg de peso). Uma emenda ao protocolo foi realizada a partir desse nível de dose devida à total ausência de toxicidade nos níveis I, II e III. A partir desse ponto, o RC-3095 foi escalonado através da administração do agente 2 vezes ao dia nos níveis de dose IV e V.

Esta escala de doses foi proposta após a observação em laboratório de que a interação desta droga com receptores de BNPs é mais favorável em vários modelos experimentais em termos de inibição do efeito de crescimento autócrino. Desde modo, os níveis de dose IV e V foram de 32 µg/kg e 48 µg/kg administrados em 2 doses diárias, respectivamente. Cada ciclo do RC-3095 foi administrado diariamente por 21 dias consecutivos. Foram incluídos 3 pacientes nos níveis de dose I a V. Devido à não observação de efeitos tóxicos no nível de dose V, procedemos o escalonamento de dose para o nível VI, ou seja, 96 µg/kg, 2 vezes ao dia, com a inclusão de mais 10 pacientes.

Apesar do objetivo principal de um estudo fase I ser identificar uma dose adequada e segura para ser aplicada em estudos fase II, foram observados efeitos antitumorais em alguns pacientes, como por exemplo um caso de regressão tumoral em uma paciente com carcinoma medular de tireóide avançado. A paciente havia desenvolvido metástases pulmonares e hepáticas múltiplas, não respondendo ao tratamento com Interferon-alfa e análogos da somatostatina. A paciente apresentou uma redução de cerca de 30% no produto do diâmetro das lesões mensuráveis em linfonodos supraclaviculares.

Concomitantemente, houve resolução de um quadro de diarréia crônica de tipo secretória e altamente debilitante, a qual havia sido interpretada como relacionada indiretamente à neoplasia (presença de peptídeos vasoativos – VIPoma) pela equipe. A duração desta resposta foi de 12 semanas. Mais interessante, esta paciente apresentava uma neoplasia com alta experessão de receptores de GRP (Figura 4). Infelizmente, houve posterior progressão da doença no fígado e o tratamento foi interrompido. Em outros dois pacientes com adenocarcinoma de próstata hormônio-independente, houve redução dos níveis séricos do PSA transitoriamente.

No sentido de avaliar os efeitos farmacodinâmicos do RC-3095, foram coletadas amostras de sangue de vários pacientes para a dosagem de gastrina e vários fatores de crescimento, como EGF, VEGF, IGF e FGF. Além disso, amostras de tecidos sadios (pele) e neoplasia foram avaliadas pela técnica de imunoperoxidase para a expressão de receptores de fatores de crescimento e do fator de liberação da gastrina. Além disso, a dose de 96 µg/kg por via subcutânea foi testada em um indivíduo portador da síndrome de Zolinger-Ellison, claramente hipergastrinêmico (cerca de 20 vezes o valor normal). Após 6 horas de uma única administração de RC-3095, os níveis de gastrina no plasma reduziram-se para cerca de 50% do valor inicial (Figura 5).

EFEITOS DO RC-3095 EM DESORDENS NEUROPSIQUIÁTRICAS

Existem várias linhas de evidência indicativas de que os BNPs possam estar envolvidos em alterações neuroquímicas associadas a doenças psiquiátricas e neurológicas.^{(40,41,42,43,44)} O GRP e seu receptor estão distribuídos no sistema nervoso central de mamíferos e níveis anormais de BNPs têm sido encontrados em pacientes com doenças como esquizofrenia e doença de Parkinson.^(45,46) Disfunções nas vias de transdução de sinais mediadas por cálcio intracelular têm sido descritas em fibroblastos de pacientes com doença de Alzheimer. Uma translocação no gene do receptor do GRP tem sido descrita em pacientes com autismo.⁽⁴⁷⁾

Estudos farmacológicos e genéticos em roedores têm demonstrado que os receptores de GRP em áreas como a região dorsal do hipocampo e a amigdala são importantes na regulação da plasticidade sináptica e em aspectos do comportamento que podem estar alterados em desordens como ansiedade, depressão, demência e outras.⁽⁴⁸⁾ Várias modificações comportamentais têm sido descritas em roedores sob a influência de receptores de GRP, tais como ingesta alimentar, estereotipia, retenção de memória e aprendizado motivado por emoção. Considerando as observações acima, poder-se-ia considerar os BNPs e a via mediada por receptores de GRP um potencial alvo terapêutico nas doenças do sistema nervoso central.⁽⁴⁹⁾

EFEITOS DO RC-3095 EM DESORDENS INFLAMATÓRIAS E NA SEPSE EXPERIMENTAL

Diversos mediadores têm sido implicados na gênese e perpetuação de doenças inflamatórias agudas. Recentemente, alguns estudos publicados na literatura têm demonstrado o papel do peptídeo liberador de gastrina (GRP) na regulação da resposta imune. Estes peptídeos estão relacionados com a ativação de macrófagos alveolares, tendo participação na gênese da fibrose pulmonar idiopática. A administração intratraqueal de bombesina (um peptídeo semelhante ao GRP) induz resposta inflamatória em babuínos.⁽⁵⁰⁾

Tem-se demonstrado, também, o seu papel na fisiopatologia de doenças inflamatórias intestinais.⁽⁵¹⁾ A administração de bombesina diminui a infiltração neutrofílica e a hipomotilidade intestinal associada a lesão térmica e melhora a lesão tecidual em modelo animal de colite.^(52,53) Além disso, os GRP estimulam a ativação da cicloxigenase-2 em uma via dependente de AP-1.⁽⁵⁴⁾

Portanto, as doenças inflamatórias agudas, especificamente hepatite severa aguda, síndrome da angústia respiratória aguda (SARA) e sepse, bem como as doenças inflamatórias crônicas podem ser também um alvo para o tratamento com inibidores de GRP, uma vez que a hiperfunção imune está associada a estas doenças. Até o presente não há registro de nenhum estudo publicado na literatura abordando o papel desta via de estimulação em doenças inflamatórias agudas ou a possibilidade de seu tratamento experimental com antagonistas de BNPs.^(55,56,57)

A grande morbidade e mortalidade relacionada a SARA, sepse e as doenças inflamatórias crônicas, aliada ao seu grande custo financeiro e social, justifica a busca de novas estratégias de tratamento. Uma vez que existem evidências de que a via de estimulação sinalizada pelo GRP parece ter importância na fisiopatologia destas doenças, os potenciais efeitos terapêuticos do RC 3095, um antagonista específico dos receptores de GRP, parecem de grande interesse clínico.^(58,59)

O RC-3095 Modula a Liberação de TNF-a e IL-1b, mas não a de IL-10 em Macrófagos Peritoneais

Estimulamos culturas primárias de macrófagos peritoneais de ratos com endotoxina e, após, as tratamos com RC-3095. O antagonista GRP atenuou o TNF-a induzido por LPS e o acúmulo de IL-1b nos meios de cultura de macrófagos. Esse efeito foi mais pronunciado a 10 µg/ml (Tabela 1), mas era evidente a 1 µg/ml (dados não mostrados). O antagonista GRP não interferiu na liberação da citocina antiinflamatória IL-10 em ambas as dosagens estudadas.

Estes resultados eram semelhantes quando macrófagos peritoneais dos ratos CLP foram estudados. A liberação de TNF-a e IL-1b, mas não de IL-10, por macrófagos ativados por CLP foi atenuada, com uma inibição máxima de 50% a uma concentração de 10 µg/ml (Tabela 2). RC-3095 a 1 µg/ml também atenuou TNF-a e IL-b liberada por macrófagos ativados por CLP.

O Tratamento com RC-3095 Melhora a Sobrevida dos Animais na Sepse Experimental

Para determinar se o tratamento com RC-3095 poderia atenuar os níveis de TNF-a e IL-1b circulantes durante a sepse, realizamos CLP, um modelo animal clinicamente relevante para a sepse humana por causar peritonite letal produzida por uma infecção polimicrobiana. Iniciamos o tratamento seis horas após a indução da sepse, quando o rato demonstrava sinais claros de sepse. Essa administração de RC-3095 atenua os níveis de TNF-a e IL-1b circulantes 24 horas após a indução de sepse (Tabela 3).

Conforme demonstrado na liberação de IL-10 de macrófagos, RC-3095 não modulou os níveis de IL-10 circulante durante a sepse. Essa administração adiada de RC-3095 melhorou significativamente a sobrevida quando administrada com suporte básico (Figura 6). A administração de RC-3095 seis horas após CLP uma vez ao dia por um dia não melhorou a taxa de mortalidade, em comparação com o “suporte básico” (dados não mostrados), mas o efeito protetor foi acentuado em animais que receberam RC-3095 uma vez ao dia por dois dias. A administração de RC-3095 uma hora antes ou uma hora após CLP sem suporte básico melhorou significativamente a taxa de sobrevida em cerca de 50% (dados não mostrados).

Figura 6. O antagonista peptídeo liberador de gastrina (RC-3095) melhora a taxa de sobrevida
em sepse "estabelecida". A sobrevida foi analisada em ratos de Wistar submetidos a ligação cecal e
perfuração. Os dados são mostrados como percentual de animais sobreviventes
(n=32 no grupo 1 e n=40 no grupo 2; *p<0,01)

O tratamento com RC-3095 atenuou o dano oxidativo em vários órgãos associados à resposta séptica, conforme avaliado pelos níveis de TBARS e carbonil proteína. Esse efeito foi mais pronunciado no rim, íleo e coração. O tratamento com RC-3095 conseguiu atenuar algumas das alterações histopatológicas constatadas na observação microscópica ótica. O antagonista GRP diminuiu a infiltração inflamatória ileal, o edema alveolar e a infiltração inflamatória e a ocorrência leve de necrose tubular renal. A proteção contra dano ileal também foi evidenciada pela redução para um terço da contagem de bactérias nos gânglios linfáticos mesentéricos.

O RC-3095 Atenua o Dano em Lesão Pulmonar Aguda Experimental

Para determinar os efeitos do RC-3095 em outros modelos animais de doenças inflamatórias, realizamos estudos em um modelo experimental de ALI induzida por LPS. O tratamento com RC-3095 após indução de ALI protege parcialmente o parênquima pulmonar contra o dano oxidativo induzido por LPS. Antagonista GRP atenuou a infiltração inflamatória alveolar e a secreção alveolar induzida por LPS. Essas descobertas foram embasadas pelo conteúdo BALF de células inflamatórias, LDH e conteúdo da proteína. A administração de RC-3095 reduziu o conteúdo de células inflamatórias total BALF e a secreção de proteína. Além disso, o tratamento com RC-3095 diminuiu o conteúdo de LDH BALF (como parâmetro de lesão celular alveolar).

DISCUSSÃO

Nesta revisão foram discutidos aspectos relacionados ao uso experimental do antagonista de receptores de BNPs, RC-3095, em neoplasias, desordens neuropsiquiátricas e em doenças inflamatórias, incluindo sepse induzida em roedores. No futuro próximo, ensaios fase II serão iniciados em pacientes com diferentes tipos de neoplasias avançadas, especialmente naquelas em que houve evidência de efeitos biológicos do RC-3095 em estudos preliminares. Nestes estudos, serão buscadas correlações entre a atividade biológica e a expressão de receptores de BNPs em tecidos-alvo.
Paralelamente, serão implementados estudos pré-clinicos no sentido de explorar com maior profundidade a potencialidade do RC-3095 em doenças neuropsiquiátricas. Estamos iniciando no presente um estudo sobre a expressão do gene do GRP em pacientes com autismo. Há também evidências de que os efeitos do RC-3095 em modelos de memória sejam dose-dependentes. Desta forma, buscaremos oportunidades de elucidar a eventual possibilidade de seu uso terapêutico.

Um aspecto muito alentador diz respeito ao uso do RC-3095 e outros inibidores dos BNPs nas doenças inflamatórias, cardiovasculares e na sepse. Um pedido de patente para estas indicações foi recentemente submetido ao instituto de patentes dos EUA. Esta patente se fundamenta nos efeitos benéficos observados com o RC-3095 em um modelo bem estabelecido para sepse experimental e lesão pulmonar aguda. O RC-3095 modula a liberação de citocinas pró-inflamatórias (TNF-a e IL-1b) por macrófagos ativados, o que leva a uma diminuição do dano oxidativo, da infiltração inflamatória e da disfunção orgânica.

Sabe-se pouco sobre os efeitos fisiológicos do GRP na função imune e a possibilidade de explorar essas funções quanto à abordagem farmacológica das condições inflamatórias. Nossos resultados sugerem que o RC-3095 pode inibir a liberação de TNF-a e IL-1b de macrófagos ativos, o que poderia representar um alvo farmacológico possível para controlar a inflamação sistêmica. No momento, estamos também explorando este efeito protetor pelo RC-3095 em vários modelos animais de condições inflamatórias, incluindo reestenose pós-angioplastia e doenças inflamatórias. 3

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